DNA İZOLASYONU

DNA izolasyonu temelde 2 aşamadan meydana gelir.
1. Hücre duvarının parçalanması
2. DNA-protein kompleksinin çözülmesi ve diğer moleküllerden ayrılması

Hücre Duvarının Parçalanması: Hücrenin çekirdeğindeki DNA’ya ulaşmak için hücre duvarının parçalanması gerekmektedir. Parçalama fiziksel ve kimyasal yollarla yapılabilir. Fiziksel olarak ısıtılan hücreler aynı zamanda kimyasal karışımlara tabi tutularak duvarın parçalanması sağlanır. Bu kimyasal karışım içinde bulunan tuz, hücre duvarından geçerek proteinleri DNA’ dan ayırır. Deterjan ise hücre duvarının geçirgenliğini arttırarak hücre içeriğinin serbest kalmasını sağlar. EDTA magnezyumu bağlayarak DNaz aktivitesini inhibe eder böylece DNA stabil halde kalabilir. Protein parçalayıcı enzimler ise hücre içeriğindeki proteinleri parçalayarak, sonraki aşamalar açısından homojen bir karışım oluşmasını sağlamaktadırlar. Hücre içinde bulunan RNA’lar tek iplikçik halde stabil olabildiklerinden onların da ortamdan uzaklaştırılması gerekir ve bunun için de RNaz enzimi kullanılır.

Parçalama aşamasında kullanılan kimyasallar ve süre DNA’sını elde etmek istediğiniz materyale göre değişiklik gösterebilir. Örneğin, bazı bakterilerin DNA’sını elde ederken, farklı yapıdaki duvarı için lizozim adlı farklı bir enzim kullanılır ve süre daha uzun tutulabilir. Yine aynı şekilde kandan DNA izolasyonu için harcanan parçalama süresi, dokudan DNA izolasyonu için harcanan süreden daha azdır.

DNA-Protein Kompleksinin Çözülmesi ve Diğer Moleküllerden Ayrılması: Bu yöntem genellikle denatürasyona dayanır. Ancak günümüzde teknolojinin de gelişimi ile DNA’yı tutma özellikli spin kolonları da kullanılmaya başlamıştır. Denatürasyona dayalı kimyasal çözülmede çoğunlukla fenol ekstraksiyonu işlemi kullanılır. Fenol ile proteinler ve DNA fragmanları birbirinden ayrılır ve uzaklaşmaları sağlanır.
Spin kolonlarının kullandığı fiziksel çözülmede ise, özel solüsyonlar ile DNA’nın tüpler içine özel olarak yerleştirilen matriks tabakasına tutunması sağlanır. Aynı aşamada DNA haricindeki moleküller matrikse tutunamadığı için ortamdan uzaklaşır. Spin kolonlar belirli solüsyonlar ile yine DNA harici maddelerin tamamen uzaklaşması için “yıkama” denilen işleme tabi tutulurlar. Son aşamada ise DNA ile matriksi birbirinden elimine eden solüsyonların kullanıldığı “Elüsyon” aşaması vardır ve bu aşama ile birlikte DNA son halini almaktadır.

Elde edilen DNA’nın saflık ve miktar belirlenmesi nasıl yapılmaktadır?
PCR aşamasında elde edilen DNA’dan reaksiyon başına yaklaşık olarak 40–100 ng kullanılır. DNA konsantrasyonu ve elde edilen DNA’nın temizliği spektrofotometre kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla 260/280 absorbans değerlerinin ölçülebildiği bir UV spektrofotometreye ihtiyaç duyulmaktadır.

DNA' nın miktar ve saflığı, spektrofotometrede 260 ve 280 nm dalga boylarında elde edilen değerlerden belirlenmektedir. Optik dansite (OD) çift iplikli DNA için 50 μg/ml, tek iplikli DNA veya RNA için 40 μg/ml ve oligonükleotidler için 20 μg/ml' ye karşılık gelmektedir. Örnek olarak çift iplikçikli DNA için miktar tayininde aşağıdaki formülden yararlanılmaktadır;

DNA (μg/ml)=260 nm'deki OD (Absorbans değeri) x sulandırma oranı x 50

DNA’nın temizliği için A (260 /280) ve A (260 /230) değerlerine bakılmaktadır. Çünkü DNA 260, protein 280 ve karbonhidratlar da 230 nm dalga boylarında pik (en yüksek değer) yapmaktadır. Temiz bir DNA’ da A (260 /280) oranı 1.80 ile 2.00 arasında; A (260 /23 0) oranı ise 2.00 den büyük; A (320) ise 0’ a yakın olmalıdır. 1.8’in altında elde edilen A (260 /280) değeri protein kontaminasyonunu, 2’nin üzerinde elde edilen A (260/280) değeri de RNA kontaminasyonunu işaret etmektedir. PCR yönteminde ne kadar saf ve yüksek molekül ağırlıklı DNA izole edilebilirse bantların belirginliği ve üretilebilirliği o derece artmaktadır.