Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR),
in vitro koşullarında DNA dizilerinin
çoğaltılması esasına dayanmaktadır.
PCR; basit, spesifik ve hassas bir
tekniktir . PCR tekniği, temelde üç
aşamadan oluşmaktadır.
1. DNA Zincirinin Açılması
(Denaturation):
Kalıp DNA (template DNA), 92-95 o
C’de 1-2 dakika tutularak çift sarmal
yapıdaki DNA iplikçikleri birbirlerinden
ayrılmaktadır. DNA zincirini ayırmak
için, bazı durumlarda 5-10 dakika ön
ısıtma yapmak gerekebilir
2. Primerlerin Açılan DNA
Zincirlerine Yapışması (Annealing):
Reaksiyon sıcaklığının, 37-65 o
C’ye
düşürülerek oligonükleotid primerlerinin
açılan DNA zincirlerinin kendi baz
dizilerine karşılık gelen bölgeye
yapışması işlemidir. Bu işlem,
üretilecek baz uzunluğuna bağlı olarak
30-60 saniyede gerçekleşmektedir.
3. Primer Uzaması (Primer Extesion):
DNA zincirleri üzerine yapışan
primerlerin DNA polimeraz enzimi (Taq
DNA polymerase) vasıtasıyla
uzatılmasıdır. Taq DNA polymerase 72 o
C sıcaklıkta daha iyi çalıştığı için genel
olarak tüm çoğaltma işlemleri bu
sıcaklıkta yapılmaktadır (Erlich ve ark.
1991). PCR sonucunda elde edilen ürün,
çoğaltılması hedeflenen DNA parçası ile
iki primerin toplam uzunluğu kadardır. Üç basamaktan
(denaturation, annealing, primer
extension) oluşan işlem, bir PCR devrini
temsil eder. Bu işlem, genel olarak 25 ile
40 defa tekrar edilerek başlangıçtaki
DNA dizisinden milyonlarca yeni DNA
parçacığı çoğaltılır. PCR sonucunda elde
edilen DNA parçacıkları agaroz veya
poliakrilamit jellerde yürütüldükten
sonra, ethidium bromide (EtBr) veya
gümüş nitrat (GN) ile boyanarak
gözlemlenir.
http://labmarket.sinanson.com/
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder